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干货丨PCR功能简介
发布时间:2019-02-28   点击次数:173次
年初,中国科幻电影“小破球流浪地球”持续热映,片中洗脑循环的经典台词让观众会心一笑,小宝觉得这句话用在科研界一样适用:新手除了了解基本的实验操作原理及步骤之外,还应对实验仪器有大致的认知,能够让仪器辅助实验顺利进行。

在初次接触PCR仪时,小白们都会有各种各样的困惑。譬如:PCR仪上的热盖和PCR管盖作用一样吗?,不同品牌的热盖都是一样的吗?热启动又是什么意义?两个加热模式哪种情景适用?带着这些问题,小宝给大家一一解答!

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众所周知,PCR仪又称热循环仪,是配合PCR过程的专用变温仪器,热盖是仪器上方的一部分,用来免样品在高温环境下蒸发冷凝在管盖上而减少反应样品体积的风险。

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PCR又称聚合酶链反应,是体外扩增目的DNA片段的方法,在多方面广泛应用,主要分为三大步骤:高温变性、低温退火、适温延伸。分别添加引物、模板、Taq酶、dNTP和缓冲液等反应物混合,在约为95℃环境下,双链DNA氢键断裂解旋为单链;单链与人工设计的引物在约为60℃温度下,按照碱基互补配对的原则相结合;并升温到72℃左右,利用Taq酶延伸合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链

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在此过程中,某段温度会接近或高于100℃,部分样品会随着高温向上蒸发,遇上温度较低的PCR管盖,则会冷凝在管盖上,管内的样品就会有一定损失,少一部分没有参加循环,造成样品得率降低。

在此之前仪器还不具备这个装置,是通过样品里滴加石蜡油来解决此问题的,但实际上后续对石蜡油的处理较为繁琐。后续热盖的出现能够有效避免该风险,热盖的温度一般都会比模块高5-10℃,这样模块内的PCR管上端温度始终大于反应液的温度,由于高温处压强大于低温处压强,液体不会向上蒸发,于是所有的样品反应液体积不会发生变化。

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但由于样品管的高度不一,早期的仪器不可调热盖只能用于统一高度的样品管,当使用较矮的样品管时,需要加入铝块,较为麻烦;目前可调式热盖分为旋钮式自调节式等:有些仪器旋钮式热盖的高度和压力是根据样品管可调整:但换样之前需要将旋钮旋回原位。并且存在压力不好控制的问题:过紧会使样品管变性等;过松则无法达到相应温度影响结果。自调节则可根据样品管高低调节高度。



所谓热启动则是在样品管中添加的Taq酶用于适温延伸这一步骤,但往往在室温的环境下,Taq酶也能发挥作用,因此在加反应物或是高温变性前,都需要防止Taq酶在非适当温度下开始工作,以避免该情况下非特异性产物。模板和酶数量一定,产生非特异性的产物,这说明特异性产物含量会降低,因此,会在冰上加样,或是先预热PCR仪,再迅速放入PCR管。



还可以将凝固冷却的蜡将引物,Mg2+,dNTP,和缓冲液混合和剩余反应组分上、下层隔离开来。在变性阶段,蜡受热熔化,所有成分混合,且液态蜡浮到样品的上部,充当热盖的作用,但后续蜡处理较为棘手。利用化学修饰或者制备抗原抗体复合物等方法使得其按照温度高低控制酶活性。


石蜡熔化示意图(管内黄色部分为石蜡)

 

 

面对高通量的样品,手动热启动防护会十分耗时,因此,PCR仪会设定热盖温度,当热盖加热到一定温度之前,模块温度保持不变;热盖温度达到设定值时,模块迅速升温,达到热启动的效果。

 

另外,很多PCR仪在加热模式上有Tube、Block两种方式可选。这是因为仪器的温度传感器在模块下部,实际上无法测得样品管内的温度。一般情况(Block)下,在输入设定温度及运行时间时,指的是模块在到达指定温度下持续相应的时间,样品管的温度不能迅速达到指定的温度;而Tube模式是先将模块温度高于设定温度,等样品管温度到达指定温度,再将模块温度降到指定温度,这样能快速使管内温度达到设定值。不同反应体积和要求可使用不同的模式:普通PCR或体积较大使用Tube模式,当长时间保温且对温度过冲要求较高或是体积较小时,可以使用Block模式。

 

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